Ako vykonať bakteriálnu chromozomálnu extrakciu?
Pridajte 400 ul zmesi fenol: chloroform (nebezpečný) a potom roztok 2 minúty prevracajte.
Bakteriálna extrakcia chromozomálne sa vykonáva v poradí sa izolovať a čistiť genóm baktérie pre ďalšie štúdium. Táto izolovaná DNA sa potom môže použiť na ďalšie štandardné experimenty, ako je PCR, vysokovýkonné sekvenovanie a ďalšie. Dôležitosť izolácie genómu nemožno podceňovať, takže dobrý a odpúšťajúci postup pri extrakcii bakteriálnej DNA zlepší laboratórne výsledky. Metóda sa vykonáva tak často, že väčšina skúsených členov laboratória si zapamätá všetky kroky.
Časť 1 z 2: prvý deň
- 1Kultivujte bakteriálne bunky do stacionárnej fázy v rastovom roztoku (2,0 ml) cez noc v laboratórnom trepačke (trepačke). Nechajte trepačku inkubovať bunky pri 37°C.
Časť 2 z 2: druhý deň
- 11,5 ml bunkových roztokov sa centrifuguje 3 minúty pri 5700 ot./min.
- 2Po odstreďovaní odpipetujte 1,5 ml supernatantu a na dne skúmavky ponechajte iba peletu.
- 3Peletu znova suspendujte v 360 ul fyziologického roztoku
- 4Pridajte 40 ul lyzozýmu do roztoku a inkubujte pri 37°C v teplom vodnom kúpeli 35 minút.
- 5Pridajte 400 ul fenolu (nebezpečného) a roztok 2 minúty prevracajte.
- 6Centrifugujte 5 minút pri maximálnej rýchlosti.
- 7Z roztoku pipetujte organickú vrstvu fenolu (nebezpečného) (asi 400 ul).
- 8Pridajte 400 ul zmesi fenol: chloroform (nebezpečný) a potom roztok 2 minúty prevracajte.
- 9Centrifugujte 5 minút pri maximálnej rýchlosti.
- 10Organickú vrstvu fenolu: chloroformu (nebezpečného) (asi 400 ul) odpipetujte z roztoku.
- 11Pridajte 400 ul chloroformu (nebezpečný) a potom roztok 2 minúty prevracajte.
- 12Centrifugujte 5 minút pri maximálnej rýchlosti.
- 13Z roztoku pipetujte organickú vrstvu (nebezpečného) chloroformu (asi 400 ul). Opatrne zlikvidujte všetok odpad z fenolu a chloroformu v oddelenej nádobe na nebezpečný odpad.
Z roztoku pipetujte organickú vrstvu fenolu (nebezpečného) (asi 400 ul). - 14Pridajte 800 ul 100% etoh do vodnej vrstvy a opakovane prevracajte (malo by dôjsť k vyzrážaniu DNA).
- 15Uchovávajte v mrazničke pri -20°C 30 minút, aby sa zvýšilo vyzrážanie DNA.
- 16Centrifugujte 15 minút pri maximálnej rýchlosti a odpipetujte vodnú vrstvu, kým nezostanú len pelety na dne skúmavky.
- 17Peletu znova suspendujte pridaním 300 ul 70% etohu a potom centrifugujte 5 minút pri maximálnej rýchlosti.
- 18Vodnú vrstvu odpipetujte, kým nezostane iba peleta, a potom peletu resuspendujte v 200 ul vody.
- 19Opakovaným preklopením skúmavky suspendujte peletu vo vode. Určite nevorte, pretože to poškodí DNA!
- 20Uchovávajte pri 4°C.
- Bezpečnostné obavy: Fenol a chloroform sú vysoko škodlivé chemikálie, ktoré v prípade kontaktu poškodzujú pokožku. S oboma zachádzajte opatrne. Odpad zlikvidujte krokmi obsahujúcimi fenol a chloroform v odpadovom kontajneri na fenol a chloroform.
- Pri použití týchto chemikálií sa dôrazne odporúča používať rukavice. Nenechajte prehltnúť niektorý z týchto látok buď.
Prečítajte si tiež: Ako písať zlomky?
