Ako extrahovať DNA hrdzavých húb kolonizovaných v rastlinnej hmote?
Opisuje sa postup extrakcie DNA z húb hrdzavejúcich kolonizovaných na akejkoľvek rastlinnej hmote.
Opisuje sa postup extrakcie DNA z húb hrdzavejúcich kolonizovaných na akejkoľvek rastlinnej hmote. Konečný produkt je zmesou primárne hubovej DNA a malého množstva rastlinnej DNA v roztoku, ktorý je možné použiť pri PCR amplifikácii. Očakávajú sa predchádzajúce skúsenosti s mokrým laboratóriom. Upravené podľa protokolu výrobcu.
- 1Do skúmaviek s lyzačnou matricou C pridajte 25-25 mg infikovaného listového tkaniva (veľkosť pripináčika) a 20-25 mg kremeliny (odmerka špáradla)
- 2Vzorky umiestnite na 20 s do homogenizátora MP fastprep 24 na rýchlosť 4.
- 3Pridajte 600 µl genomického lyzačného pufra s proteinázou K. Rýchlo premiešajte vortexovaním.
- 4Inkubujte 1 hodinu pri 60°C. Obráťte každých 15 minút a premiešajte.
- 5Necháme vychladnúť na izbovú teplotu.
- 6Pridajte 200 µl chloroformu. Invertovať na mixovanie.
- 7Odstreďujte pri najvyššej rýchlosti 10 minút.
- 8Supernatant (horná vrstva) sa prenesie do čistej 1,5 ml skúmavky. Zlikvidujte predchádzajúcu skúmavku.
- 9Pridajte 50 µl roztoku na stripovanie DNA. Invertovať na mixovanie.
- 10Inkubujte 1 hodinu pri 60°C.
- 11Rýchlo položte na ľad na 5 minút.
- 12Pridajte 100 µl zrážacieho roztoku. Invertovať na mixovanie. Ak sa nevytvorí biela zrazenina, pridajte ďalších 50 µL
- 13Odstreďujte pri najvyššej rýchlosti 5 minút.
- 14Bez narušenia pelety preneste supernatant do čistej 1,5 ml skúmavky. Zlikvidujte predchádzajúcu skúmavku.
Ak sa peleta sama nerozpustí, inkubujte 5 minút pri 37°C. - 15Pridajte 5 μl mušľového glykogénu a 500 μl izopropanolu.
- 16Na premiešanie prevráťte najmenej 50 -krát.
- 17Odstreďujte pri najvyššej rýchlosti 10 minút. Možno budete chcieť usporiadať skúmavky v rovnakom smere, takže peleta je po centrifugácii vždy na tej istej strane.
- 18V spodnej časti by mala byť malá peleta. Supernatant vylejte, pričom buďte veľmi opatrní, aby ste nevypustili peletu DNA. Ak nie je žiadna peleta, musíte sa pokúsiť o extrakciu znova.
- 19Pridajte 100 µl TE pufra do pelety. Ak sa peleta sama nerozpustí, inkubujte 5 minút pri 37°C.
- 20Extrakcia DNA je dokončená. Možno budete chcieť vyhodnotiť kvalitu/množstvo DNA na agarózovom géli.
- Na použitie v PCR: Pripraví 1:10 riedenie extrakcie DNA. Ak to nefunguje, skúste 1: 100. Príliš veľa DNA môže brániť reakcii PCR.
Prečítajte si tiež: Ako písať zlomky?
