Ako identifikovať baktérie?

Grampozitívne baktérie majú extra hrubú bunkovú stenu (vyrobenú z polyméru nazývaného peptidoglykán), ktorá drží farbivo lepšie ako tenšie bunkové steny gramnegatívnych baktérií.

Vo väčšine prípadov sa identifikácia baktérií vykonáva prostredníctvom procesu eliminácie, aby sa zúžili možnosti, kým sa nedostanete k tej správnej. Robiť to správne je neuveriteľne zložitý proces, čiastočne preto, že existuje toľko typov-niektorí vedci odhadujú, že počet druhov baktérií môže byť viac ako miliarda! Aj keď je z čoho vyberať, identifikácia je obzvlášť dôležitá v klinickom a lekárskom prostredí. Aby to bolo jednoduchšie, existujú normy na identifikáciu, ktoré pochádzajú z používania techník farbenia na skúmanie vzhľadu baktérií a sledovanie reakcií baktérií na rôzne podmienky.

Metóda 1 zo 4: identifikácia baktérií gramovým farbením

1
Pomocou gramového farbenia zistíte, či sú baktérie grampozitívne alebo gramnegatívne. Gramové farbenie je postup, ktorý vám umožňuje rozdeliť baktérie na 2 bežné typy: grampozitívne a gramnegatívne. Grampozitívne baktérie majú extra hrubú bunkovú stenu (vyrobenú z polyméru nazývaného peptidoglykán), ktorá drží farbivo lepšie ako tenšie bunkové steny gramnegatívnych baktérií.
- K bežným rodom grampozitívnych baktérií patrí Staphylococcus, Streptococcus, Micrococcus a Listeria.
- K bežným rodom gramnegatívnych baktérií patria Neisseria, Moraxella, Acinetobacter, Enterobacteriaceae, Haemophilus, Vibrio, Campylobacter a Fusobacterium.
2

Používajte bezpečnostné opatrenia. Baktérie a chemikálie, s ktorými budete manipulovať počas Gramovho farbenia, sú potenciálne nebezpečné. Pri odstraňovaní škvŕn noste ochranné okuliare, jednorazové nitrilové rukavice a laboratórny plášť. Keď skončíte, vložte jednorazové rukavice a akýkoľvek iný kontaminovaný odpad do vrecka na biologické nebezpečenstvo. Pri likvidácii vaku s biologickým nebezpečenstvom postupujte podľa pokynov svojho laboratória.
3

Vytvorte sklíčko zo svojej bakteriálnej vzorky. Na začiatku postupu položte malú kvapku alebo kúsok vzorky vašej baktérie na sterilné podložné sklíčko. Sklíčko nechajte 3krát prejsť plameňom Bunsenovho horáka, aby sa vzorka zafixovala teplom. Tým sa zabráni zmývaniu vzorky, keď pridáte činidlá alebo opláchnete sklíčko.
4
Na sklíčko pridajte 5 kvapiek kryštálovej fialky. Kvapky kryštálovofialového farbiva naneste na tepelne fixovanú kultúru. Vzorku nechajte 1 minútu namočiť do kryštálovofialového farbiva.
- Aby ste si neznečistili ruky, možno budete chcieť sklíčko držať na mieste špendlíkom.
5

Sklíčko jemne opláchnite, aby ste odstránili škvrnu. Použite veľmi jemný prúd vody z umývadla alebo striekacej fľaše. Neoplachujte dlhšie ako 5 sekúnd. Tento proces odstráni akékoľvek farbivo, ktoré nie je viazané na vzorku.
6

Na sklíčko pridajte 5 kvapiek gramu jódu. Gramov jód je roztok jódu, jodidu draselného a hydrogenuhličitanu sodného. Toto riešenie spôsobí, že kryštálovofialové farbivo sa spojí s bunkovými stenami baktérií. Pridajte asi 5 kvapiek a nechajte pôsobiť 1 minútu.
7
Vzorku opláchnite alkoholom alebo acetónom. Alkohol a acetón sú odfarbovacie činidlá. Ak sú vaše baktérie gramnegatívnym kmeňom, tieto činidlá odstránia škvrnu zo stien bakteriálnych buniek. Nechajte niekoľko kvapiek odfarbovacieho prostriedku kvapkať po vzorke a nechajte pôsobiť maximálne 3 sekundy. Jemne opláchnite vodou maximálne 5 sekúnd, aby ste odstránili alkohol alebo acetón.
- Ak necháte odfarbovací prostriedok na vzorke príliš dlho sedieť, môže odstrániť škvrnu z grampozitívnych baktérií a spôsobiť falošný gramnegatívny výsledok.
8

Roztok zafarbte safranínom. Safranin je červené farbivo, ktoré bude pôsobiť ako kontrastné činidlo voči kryštálovej fialke a zafarbí všetky baktérie, ktoré neudržali fialové škvrny. Do vzorky pridajte asi 5 kvapiek roztoku safranínu a nechajte pôsobiť 1 minútu. Veľmi jemne opláchnite vodou po dobu 5 sekúnd.
9

Zobrazte svoju vzorku pod mikroskopom pri 1000 -násobnom zväčšení. Ak sú baktérie grampozitívnym kmeňom, objavia sa pod mikroskopom purpurové alebo fialové. Gramnegatívne baktérie budú v safranínovom kontraste zafarbené na červeno.

Metóda 2 zo 4: pomocou techniky farbenia ziehl-neelsen

1

Na detekciu kyselinovzdorných baktérií použite farbenie ziehl-neelsen. Kyslo-rýchle baktérie obsahujú vyššie množstvo lipidov ako ostatné druhy baktérií, vďaka čomu sú odolné voči farbivám používaným pri Gramovom farbení. Kyslo-rýchle baktérie patria do rodu Mycobacterium, ktorý zahŕňa baktériu, ktorá spôsobuje tuberkulózu (M. tuberculosis). Kyslo-rýchle baktérie je možné zafarbiť červeným karbol-fuchsínovým farbivom, ktoré odolá opláchnutiu roztokom kyslého alkoholu alebo kyseliny sírovej.
2
Vykonajte náležité bezpečnostné opatrenia. Chemikálie a biologické materiály použité počas farbenia Ziehl-Neelsen môžu byť nebezpečné. Budete tiež používať zdroje tepla, ako napríklad Bunsenov horák, duchovú lampu alebo elektrický diapozitívny ohrievač. Pri vykonávaní tohto postupu urobte nasledujúce opatrenia:
- Noste ochranné okuliare, nitrilové rukavice a laboratórny plášť.
- Dávajte pozor, aby ste nevdychovali výpary z roztokov na farbenie a odfarbovanie, ani aby sa nedostali na vašu pokožku alebo do očí. Všetky otvorené nádoby uchovávajte pod digestorom.
- Pri zahrievaní diapozitívu buďte veľmi opatrní, pretože mnohé chemikálie, ktoré budete používať, sú horľavé. Na posuvných regáloch a inom zariadení môžu byť tiež stopy horľavých chemikálií.
3

Pripravte si sklíčko. Krúživými pohybmi rovnomerne rozotrite nátierku vzorky na stred sterilného sklíčka. Váš náter by mal mať veľkosť približne 10 mm (1 centimeter) x 20 mm (2 centimetre).
4

Vysušte sklíčko. Sklíčko položte na sušiaci stojan stierkou nahor. Nechajte 30 minút schnúť na vzduchu. Nepokúšajte sa sklíčko vysušiť.
5

Teplo opravte svoj náter. Vzorku môžete tepelne zafixovať prechodom sklíčka nad plameň Bunsenovho horáka 2-3 krát, stierkou nahor. Alternatívne umiestnite sklíčko na elektrický ohrievač sklíčok na 65° -75°C (149° -75°C) najmenej na 2 hodiny. Dávajte pozor, aby ste vzorku nespálili alebo nevarili.
6

Pridajte na svoju podložku karbol-fuchsínovú škvrnu. Na sklíčko dajte niekoľko kvapiek roztoku karbol-fuchsinu. Pridajte toľko, aby bol náter úplne pokrytý.
7
Zafarbené sklíčko zohrejte, aby sa škvrna pripevnila k náteru. Jemne zohrejte sklíčko cez Bunsenov horák alebo liehovinu, stierkou nahor alebo ho umiestnite na elektrický diapozitívny ohrievač. Sklíčko zahrievajte, kým nedosiahne 60°C. Mali by ste vidieť, ako para začína stúpať. Vyhriatu škvrnu nechajte na sklíčku odstáť 5 minút.
- Ak používate elektrický posúvač, nastavte ho na 60°C. Ak používate horák alebo pálenku Bunsen, budete musieť starostlivo sledovať vzhľad pary alebo pary.
- Aby sa sklíčko udržalo na požadovanej teplote celých 5 minút, zahrievajte ho prerušovane.
- Dbajte na to, aby sa váš špinavý náter nerozvaril, nespálil alebo úplne nevyschol.
8

Sklíčko opláchnite studenou vodou. Sklíčko nechajte asi 5 minút vychladnúť a potom niekoľko sekúnd jemne opláchnite čistou vodou z vodovodu alebo z fľaše, aby ste odstránili všetky škvrny, ktoré nie sú prilepené na vzorku.
9

Nátierku zakryte kyslým alkoholom alebo kyselinou sírovou. Pridajte dostatočne 3% obj. Kyslého alkoholu (20% obj.) Alebo 20% kyseliny sírovej, aby bol náter úplne pokrytý. Nechajte kyselinu na sklíčku, kým škvrna nezmizne do veľmi svetlo ružovej farby. To zvyčajne trvá najmenej 10 minút.
10

Sklíčko opláchnite čistou vodou. Jemne opláchnite vodou z vodovodu alebo z fľaše, pričom dbajte na to, aby ste zmyli všetku kyselinu a všetky zvyšky farbiva.
11

Na snímku pridajte kontrastné farbivo. Akonáhle je podložné sklíčko opláchnuté, pokryte škvrnu malachitovou zelenou alebo Loefflerovou metylénovou modrou. Tieto roztoky vytvoria zelené alebo modré „pozadie“, ktoré pomôže vyniknúť červeno zafarbeným baktériám, a taktiež zafarbia akýkoľvek iný biologický materiál na podložnom sklíčku (napríklad ľudské bunky a baktérie, ktoré nie sú kyslé). Nechajte škvrnu odstáť 1-2 minúty.
12

Sklíčko opláchnite a osušte. Sklíčko jemne umyte čistou vodou, aby ste odstránili prebytočné kontrastné farbivo. Keď ste hotoví, utrite zadnú časť sklíčka čistou handričkou a podložnú sklíčku položte na stojan, aby ste vysušili na vzduchu.
13

Sklíčko skúmajte pod mikroskopom pri 1000 -násobnom zväčšení. Kyslo-rýchle baktérie by mali byť červené alebo horúco ružové. Nekyslé baktérie, nebakteriálne bunky a pozadie budú mať modrú alebo zelenú farbu.

Ktorý vám umožňuje rozdeliť baktérie na 2 bežné typy — Gramové farbenie je postup, ktorý vám umožňuje rozdeliť baktérie na 2 bežné typy: grampozitívne a gramnegatívne.

Metóda 3 zo 4: pozorovanie bakteriálneho vzhľadu a správania

1
Sledujte tvar baktérií. Keď ste pomocou farbenia určili, či sú vaše baktérie grampozitívne, gramnegatívne alebo kyslé, je načase zúžiť typ baktérií. Prvým krokom je pozorovať tvar (y) baktérií na sklíčku. Tri najbežnejšie tvary sú coccus (sférické), bacillus (v tvare tyčinky) a špirálové.
- Na všetky tieto tvary existuje množstvo variácií. Baktérie koky sa môžu napríklad vyskytovať v rôznych formáciách, ako sú fúzované páry (diplococcus), reťazce, klastre alebo skupiny 4 (tetrady).
2
Zistite, či sú baktérie aeróbne alebo anaeróbne. Odoberte 2 vzorky baktérií a vytvorte 2 oddelené kultúry. 1 kultúra by mala byť anaeróbna (pestovaná bez kyslíka) a druhá by mala byť aeróbna (pestovaná s kyslíkom). Pred pokusom o pozorovanie rastu baktérií skladujte svoju anaeróbnu kultúru v prostredí bez kyslíka pri 35°C najmenej 48 hodín.
- Ak vaše baktérie rastú v prostredí bez kyslíka, ale nie vtedy, keď sú vystavené kyslíku, sú anaeróbne.
- Baktérie, ktoré rastú, keď sú vystavené kyslíku, ale nie, ak sú držané v prostredí bez kyslíka, sú aeróbne.
- Baktérie, ktoré môžu rásť v oboch prostrediach, sa nazývajú fakultatívne anaeróby.
3

Vykonajte test pohyblivosti, aby ste zistili, či sú vaše baktérie pohyblivé. Pohyblivé baktérie sa môžu samy pohybovať pomocou 1 alebo viacerých bičíkov, ktoré ich poháňajú. Motilita alebo nedostatok motility môže byť dôležitým faktorom pri identifikácii kmeňa baktérií. Existuje niekoľko typov testov pohyblivosti, ale polotuhý stredný test je najbezpečnejšie a najľahšie čitateľné.
4

Vytvorte si kultúru pre test pohyblivosti. Pripravte kultúru baktérií v živnom bujóne. Vývar pripravte podľa pokynov pre vami preferované médium pre bujón.
5
Inokulujte skúmavku s polotuhým agarom pohyblivosti svojou kultúrou. Sterilnú očkovaciu ihlu potiahnite trochou kultúry bujónu. Opatrne vpichnite ihlu priamo do skúmavky s polotuhým agarom určeným na testovanie pohyblivosti (ako je napríklad TTC agar). Ihla by mala ísť asi 0,67 cesty do agaru.
- Keď ste hotoví, opatrne vytiahnite ihlu a dávajte pozor, aby ste neporušili pôvodnú „bodnú čiaru“.
- Skúmavku inkubujte pri 30°C 48 hodín.
6

Prečítajte si výsledky testu pohyblivosti. Agar motility sa pri kontakte s baktériami zmení na červený. Ak sú vaše baktérie pohyblivé, v agare sa rozptýli červená alebo ružová farba. Ak nie sú pohyblivé, uvidíte červenú farbu iba podľa pôvodnej bodnej čiary.

Prečítajte si tiež: Ako vyrobiť čln poháňaný balónom?

Metóda 4 zo 4: dať to všetko dohromady

1
Spojte svoje postrehy. Na zúženie rodu baktérií budete musieť skombinovať informácie zo svojich škvŕn, kultúr a pozorovaní tvaru baktérií. Ak testujete kultúru od pacienta, informácie o jeho príznakoch môžu byť užitočné aj pri zúžení poľa.
- Ak napríklad vaše testy odhalili, že vaše baktérie sú gramnegatívne, anaeróbne, nepohyblivé bacily a sú u pacienta spojené s bolesťou brucha, nevoľnosťou a vracaním, pravdepodobne ide o Bacteroides fragilis.
2
Prezrite si databázu baktérií. Pretože existuje toľko druhov baktérií, je nemožné si ich všetky zapamätať alebo rozpoznať samy. Pravdepodobne budete musieť nahliadnuť do učebnice klinickej mikrobiológie alebo online databázy a hľadať baktérie so všetkými charakteristikami vašej vzorky.
- Dobré online zdroje pre identifikáciu baktérií patrí k Pathosystems Resource Integration Center (patricbrc.org) a databázy patogénnym baktériám v GlobalRPh (globalrph.com/bacterial-strains.htm).
3
Na určenie presného druhu baktérií použite genetické testovanie. V niektorých prípadoch môže byť potrebné identifikovať presný druh baktérií. Najrýchlejší a najefektívnejší spôsob, ako to dosiahnuť, je testovanie DNA. Testovanie DNA je tiež nápomocné pri identifikácii baktérií, ktoré odolávajú tradičným formám kultivácie alebo farbenia. Moderné mikrobiálne testovanie DNA je možné vykonať veľmi rýchlo, niekedy už za 2 hodiny.
- Ak nemáte prístup do laboratória, ktoré robí sekvenovanie mikrobiálneho genómu, pošlite vzorku do špecializovaného zariadenia, ako napríklad MIDI Labs alebo CD Genomics.

Kyslo-rýchle baktérie obsahujú vyššie množstvo lipidov ako ostatné druhy baktérií, vďaka čomu sú odolné voči farbivám používaným pri Gramovom farbení.

Varovania

Pri práci s mikrobiálnymi vzorkami a farbiacimi činidlami vždy používajte bezpečnostné opatrenia. Ak vám je po práci so vzorkami baktérií nevoľno, ihneď vyhľadajte lekársku pomoc.
Tieto postupy by sa mali vždy vykonávať v mikrobiologickom laboratóriu so zariadením, ktoré je v dobrom stave.

Veci, ktoré budete potrebovať

Identifikácia baktérií pomocou gramového zafarbenia

Bakteriálne vzorky
Bezpečnostné okuliare
Nitrilové rukavice
Laboratórny plášť
Mikroskopické sklíčka
Posuvný sušiaci stojan
Bunsenov horák
Duchová lampa alebo elektrický diapozitívny ohrievač
Špendlík na oblečenie
Fľaša na vodu
Gram kryštálovo fialový roztok
Gramový roztok jódu
Roztok etanolu alebo acetónu
Gram safranínový roztok
Mikroskop schopný 1000 -násobného zväčšenia

Či sú vaše baktérie grampozitívne — Keď ste pomocou farbenia určili, či sú vaše baktérie grampozitívne, gramnegatívne alebo kyslé, je načase zúžiť typ baktérií.

Technikou farbenia ziehl-neelsen

Bakteriálne vzorky
Bezpečnostné okuliare
Nitrilové rukavice
Laboratórny plášť
Mikroskopické sklíčka
Posuvný sušiaci stojan
Bunsenov horák
Duchová lampa alebo elektrický diapozitívny ohrievač
Fľaša na vodu
Digestor
Roztok karbol-fuchsin
20% kyselina sírová alebo 3% v/v kyslý alkohol
Malachitová zeleň alebo Loefflerova metylénová modrá
Mikroskop schopný 1000 -násobného zväčšenia

Pozorovanie bakteriálneho vzhľadu a správania

Mikroskop schopný 1000 -násobného zväčšenia
Aeróbne a anaeróbne bakteriálne kultúry
Živný vývar stredný
Polotuhý agil pohyblivosti
Očkovacia ihla