Ako pripraviť zásobu glycerolu?
Rovnakú nádobu použijete na infúziu roztoku glycerolu do kvapalnej bakteriálnej kultúry a vzorku umiestnite do chladničky.
Zásoba glycerolu je typ suspenzie používanej v laboratórnych podmienkach na dlhodobé skladovanie bakteriálnych kultúr. Keď sa do 50% roztoku glycerolu pridajú kvapalné kultúry baktérií, glycerol vnikne do bakteriálnych buniek, čím sa stanú štrukturálne stabilnými a umožnia ich bezpečné skladovanie. Po zmiešaní vzoriek ich zmrazte na -80°C (-44°C), aby ste zaistili, že zostanú životaschopné čo najdlhšie.
Časť 1 z 3: miešanie roztoku glycerolu
- 1Pripravte si tekutú kultúru baktérií, ktoré chcete uložiť. Aby bola zásoba glycerolu účinná, musí byť kombinovaná s kvapalnou bakteriálnou kultúrou. Na výrobu tekutej kultúry budete potrebovať inkubáciu bakteriálnej vzorky cez noc v Erlenmeyerovej banke naplnenej lyzogénnym bujónom a so správnou koncentráciou antibiotika.
- Akonáhle ste pripravili kvapalnú kultúru, môžete baktérie uložiť do zásoby alebo pokračovať v izolácii plazmidovej DNA.
- Lysogeny bujón (známy tiež ako „vývar LB“ a „kvapalina LB“) je druh tekutiny bohatej na živiny, ktorá sa používa na rýchlu propagáciu baktérií. Dá sa kúpiť v maloobchode, ktorý predáva laboratórne vybavenie a materiál.
- Inkubácia bakteriálnych kultúr je vysoko technický proces zahŕňajúci mnoho rôznych premenných. Z tohto dôvodu je najlepšie ho vykonávať vyškolený technik v kontrolovanom laboratórnom prostredí.
- 2Čistý glycerol zrieďte v destilovanej vode, aby ste vytvorili 50% roztok glycerolu. Sterilnou pipetou odmerajte 10 ml oboch kvapalín a spojte ich do jednej banky. Banku dôkladne premiešajte alebo pretrepte, kým sa kvapaliny rovnomerne nezmiešajú.
- Zriedenie glycerolu je nevyhnutné, aby sa zabránilo poškodeniu bakteriálnych buniek.
- Niektorí vedci dávajú prednosť použitiu roztoku glycerolu v koncentrácii 15 až 40%, aby sa zabránilo ohrozeniu bakteriálnej kultúry. 50% zmes však poskytne maximálnu životnosť pri skladovaní.
Konečný podiel vašej zásoby glycerolu by mal byť 50% baktérií a 50% zriedeného glycerolu. - 3Preneste 50 mikrolitrov 50% roztoku glycerolu do mikrocentrifugačnej skúmavky. Zriedený glycerol preneste opatrne do novej injekčnej liekovky, aby ste zabránili rozliatiu. Rovnakú nádobu použijete na infúziu roztoku glycerolu do kvapalnej bakteriálnej kultúry a vzorku umiestnite do chladničky.
- Ak je to možné, používajte skôr rúrku so skrutkovacím vrchom než rúrku so západkou. Je známe, že zacvakávacie skúmavky sa náhodne otvoria počas miešania a dlhšieho skladovania.
Časť 2 z 3: pridanie bakteriálnej kultúry
- 1Do roztoku pridajte 50 mikrolitrov svojej tekutej bakteriálnej kultúry. Čerstvou pipetou odmerajte rovnaké množstvo tekutej kultúry a nalejte ju priamo do roztoku glycerolu v skúmavke. Konečný podiel vašej zásoby glycerolu by mal byť 50% baktérií a 50% zriedeného glycerolu.
- Použitie neúmerných množstiev glycerolu a kvapalnej kultúry by mohlo ovplyvniť odolnosť baktérií a skrátiť dobu, ktorú je schopná prežiť v chlade.
- Ak používate roztok glycerolu s nižšou koncentráciou, budete musieť podľa toho upraviť množstvo bakteriálnej kultúry. Ďalšie informácie nájdete v literatúre týkajúcej sa presného kmeňa, ktorý skladujete.
- 2Nasaďte viečko na tubu. Zaskrutkujte veko na miesto alebo zatlačte nadol, kým nebudete počuť tiché cvaknutie, ak používate západku. Pred pokračovaním sa presvedčte, či je veko zaistené.
Aby bola zásoba glycerolu účinná, musí byť kombinovaná s kvapalnou bakteriálnou kultúrou. - 3Skúmavku jemne potraste, aby sa zmiešala bakteriálna kultúra a glycerol. Skúmavku niekoľkokrát premiešajte tam a späť, kým sa obe tekutiny nerozdelia rovnomerne. V tomto mieste začnú bakteriálne bunky pomaly absorbovať roztok glycerolu, ktorý stabilizuje a ochráni bunkovú membránu pred poškodením a poškodením súvisiacim s teplotou.
- Pri trepaní držte palec pevne pritlačený k viečku skúmavky mikrofugy, aby ste sa uistili, že sa neuvoľní.
Časť 3 z 3: skladovanie a oživovanie bakteriálnych kultúr
- 1Označte bakteriálnu vzorku. Napíšte názov kultúry na malý štítok skúmavky alebo na pásik krycej pásky a prilepte ju k mikrocentrifugačnej skúmavke, kde bude jasne viditeľná. Informácie o klasifikácii baktérií môžete tiež zapísať priamo na viečko pomocou fixky s plsteným hrotom.
- Nezabudnite tiež zaznamenať všetky ďalšie informácie, ktoré sa môžu počas analýzy ukázať ako užitočné, napríklad presný kmeň vzorky alebo jej pôvod.
- Označenie nádob na vzorky je nepostrádateľným krokom v procese zberu, pretože vám umožňuje sledovať ich obsah, keď sa miešajú v sklade a mimo neho.
- 2Vzorku zmrazte pri -80°C (-44°C). Označenú vzorku vložte do podchladeného laboratórneho mraziaka nastaveného na konštantnú teplotu -80°C (-44°C). Pri uchovávaní za týchto podmienok zostane bakteriálna kultúra životaschopná niekoľko rokov.
- Je dôležité, aby teplota mrazničky zostala fixná na -80°C (-44°C). Ak je nastavený na vyšší stupeň teploty, zachované baktérie môžu uhynúť.
Keď sa do 50% roztoku glycerolu pridajú kvapalné kultúry baktérií, glycerol sa infúziou dostane do bakteriálnych buniek, čím sa stanú štrukturálne stabilnými a umožnia ich bezpečné skladovanie. - 3Oškrabte malé množstvo mrazených baktérií, aby ste ich pripravili na analýzu. Akonáhle príde čas na oživenie vzorky, vyberte skúmavku s mikrofugou z mrazničky a otvorte veko. Pomocou sterilnej očkovacej slučky, špáradla alebo špičky pipety zozbierajte malé množstvo mrazeného materiálu z hornej časti vzorky a naneste baktérie na platňu s agarom LB na vyšetrenie alebo testovanie.
- Dávajte pozor, aby sa škrabajúce sa baktérie neroztopili. Pomôcť môže uchovanie zásobnej skúmavky na suchom ľade, kým nedokončíte testy.
- Vytiahnite vzorku z mrazničky iba vtedy, ak je to absolútne nevyhnutné. Opakované rozmrazovanie a zmrazovanie výrazne zníži jeho životnosť.
- Bakteriálna kultúra
- LB vývar
- Erlenmeyerova banka
- Skrutkovacia trubica mikroodstredivky
- Sterilná pipeta
- Superchladená laboratórna mraznička
- LB agarová platňa
- Očkovacia slučka alebo špáradlo
- Štítok alebo maskovacia páska na skúmavke
- Fixka alebo atramentové pero s plstenou špičkou
Prečítajte si tiež: Ako rozpustiť soľ vo vode?
