Ako vyrobiť fyziologický roztok pufrovaný fosfátmi?
Fosfátom pufrovaný fyziologický roztok (PBS) je slaná zmes používaná v biologickom výskume.
Fosfátom pufrovaný fyziologický roztok (PBS) je slaná zmes používaná v biologickom výskume. Používa sa na zriedenie skupiny buniek alebo na oddelenie buniek. Tento pufer udržuje stabilné pH, takže bunky nie sú zničené pri pohľade a skladovaní. Môžete si pripraviť 1X roztok, ktorý je možné použiť priamo na bunky, alebo môžete pripraviť 10 -násobný roztok, ktorý je možné zriediť až na 1X. Ak je vaša laboratórium používa veľa PBS by to mohlo byť dobrý nápad, aby sa zásoby 10x, pretože to bude trvať dlhšie.
Metóda 1 z 3: príprava 1x zásoby
- 1Zhromaždite svoje materiály a prísady. Na prípravu 1X (normálnej koncentrácie používanej na experimenty) roztoku fyziologického roztoku pufrovaného fosfátom (PBS) budete potrebovať 1-litrový odmerný valec, váhu, 2-litrovú kadičku, miešaciu tyčinku, miešaciu dosku, pH meter, autokláv a sklenenú fľašu na skladovanie. Na výrobu 1 litra PBS budete potrebovať nasledujúce množstvo každej zložky:
- Malé množstvá zriedenej HCl a/alebo NaOH na úpravu pH konečného roztoku
- 800 ml destilovanej vody
- 8 g NaCl (chlorid sodný)
- 0,2 g KCl (chlorid draselný)
- 1,44 g Na 2 HPO 4 (fosforečnan sodný)
- 0,24 g KH 2 PO 4 (fosforečnan monodraselný)
- Konečné koncentrácie každej zlúčeniny by mali byť 137 mM NaCl, 10 mM Na 2 HPO 4, 1,8 mM KH 2 PO 4, 2,7 mM KCI, a hodnotu pH 7,4.
- 2Miešaciu tyčinku vložte do kadičky a umiestnite kadičku na miešaciu dosku. Pri vytváraní akéhokoľvek riešenia chcete, aby sa riešenie neustále pohybovalo. To pomôže všetkému rýchlejšie sa rozpustiť. Aby ste predišli postriekaniu vodou, vložte miešaciu tyčinku do prázdnej kadičky a potom ju dajte na vrch miešacej platne.
- Miešacia tyčinka obsahuje magnet, ktorý umožňuje, aby sa tyč otáčala a miešala roztok, keď je na miešaciu dosku, ktorá obsahuje motor, umiestnená nádoba s tekutinou.
- Pred zapnutím kadičky počkajte, kým v nej nie je roztok.
- 3Do 2-kadičky odmerajte 800 ml destilovanej vody a potom zapnite miešaciu dosku. Pri príprave roztoku začnite s menším ako konečným objemom vody. Na konci pridáte zvyšok vody tak, aby celkový objem dosiahol 1 l. Pomocou odmerného valca odmerajte 800 ml vody a nalejte ju priamo do čistej kadičky.
- S vodou v kadičke zapnite miešaciu dosku na stredné otáčky. Keď sa miešadlo začne točiť, vo vode by ste mali vidieť malú vírivku.
- 4Odvážte správne množstvo každej chemikálie. Odváži sa 8 g chloridu sodného, 0,2 g chloridu draselného, 1,44 g Na 2 HPO 4, a 0,24 g KH 2 PO 4. Pomocou váhy zvážte každú chemikáliu naraz vo vlastných vážiacich lodiach.
- Ak pridáte priveľa chemikálií, jednoducho ich odstráňte, kým nebudete mať správne množstvo.
- 5Do roztoku pridajte všetky chemikálie a rozpustite. Nalejte každú chemikáliu do vody za stáleho miešania. Neexistuje žiadny špeciálny príkaz na pridanie každého z nich, takže môžete pridať všetko naraz. Všetko nechajte miešať, kým sa úplne nerozpustí.
- Môžete to nechať pôsobiť, kým robíte niečo iné, a skontrolovať to neskôr. Rozpustenie bude trvať najmenej 5-10 minút.
- 6Upravte ph roztoku na 7,4. Akonáhle je všetko úplne rozpustené, musíte upraviť pH pufra na 7,4. Ponechajte miešaciu tyčinku zapnutú a umiestnite pH meter do hornej časti roztoku. Nechajte čísla na pH metri prestať sa pohybovať. Roztok bude pravdepodobne príliš kyslý, takže na úpravu pH budete musieť pridať hydroxid sodný (NaOH).
- Pomocou malej pipety pridajte NaOH niekoľko kvapiek naraz. Po každom pridaní nechajte roztok chvíľu miešať a skontrolujte nové hodnoty na pH metri.
- Úprava pH roztoku je proces, ktorý vyžaduje trpezlivosť. Ak náhodou prekročíte hodnotu 7,4, môžete pridať niekoľko kvapiek kyseliny chlorovodíkovej (HCl), aby sa teplota opäť znížila.
- 7Vodu dolejte, kým roztok nebude mať 1 liter. Po správnom nastavení pH môžete svoj roztok doplniť na konečný objem 1 liter. Opatrne nalejte celý roztok z kadičky do 1-litrového odmerného valca. Pridajte dostatok destilovanej vody na objem 1 l.
- Konečný roztok nalejte do 1-litrovej sklenenej fľaše bezpečnej na autoklávovanie.
- 8Roztok sterilizujte v autokláve. Na fľašu nasaďte vrchnák, ale neskrutkujte ho. Počas autoklávovania sa tlak vo fľaši môže zvýšiť a explodovať, ak utiahnete viečko. Cez viečko prilepte pásik autoklávovej pásky, aby pri autoklávovaní držal na mieste.
- Nastavte autokláv na sterilizáciu 20 minút pri 15 psi v kvapalinovom cykle.
- Páska do autoklávu má indikátor teploty. Ak páska autoklávu po dokončení procesu nezčerná, autokláv sa dostatočne nezohrial a budete musieť sterilizovať znova.
- 9PBS skladujte pri izbovej teplote. Po autoklávovaní nechajte PBS vychladnúť na izbovú teplotu a potom utiahnite veko, aby sa nečistoty nedostali von. Uťahovanie veka skôr, ako sa fľaša ochladí, môže spôsobiť podtlak a veko je potom veľmi ťažké odstrániť. PBS je stabilný pri izbovej teplote.
- PBS môžete tiež alikvotovať do menších kontajnerov, aby ste ich mohli používať naraz.
Po každom pridaní nechajte roztok chvíľu miešať a skontrolujte nové hodnoty na pH metri.
Metóda 2 z 3: vytvorenie 10 -násobnej zásoby
- 1Zbierajte svoje materiály a prísady. Vytvorenie 10 -násobku (desaťnásobok použitej normálnej koncentrácie) je takmer totožné s výrobou 1 -násobku, jednoducho pridáte 10 -násobné množstvo chemikálií. Na výrobu zásoby 10X budete potrebovať 1-litrový odmerný valec, váhu, 2-litrovú kadičku, miešaciu tyčinku, miešaciu dosku, pH meter, autokláv a sklenenú fľašu na skladovanie. Na výrobu 1-L budete potrebovať nasledujúce množstvo každej zlúčeniny:
- 700 ml destilovanej vody
- 80 g NaCl (chlorid sodný)
- 2 g KCl (chlorid draselný)
- 14,4 g Na 2 HPO 4 (fosforečnan sodný)
- 2,4 g KH 2 PO 4 (dihydrogénfosforečnan draselný)
- Na pH konečného roztoku budete tiež potrebovať malé množstvo HCl a/alebo NaOH.
- Konečné koncentrácie každej zlúčeniny v roztoku 10X je 1,37 M NaCl, 27 mM KCI, 100 mM Na 2 HPO 4, a 18 mM KH 2 PO 4.
- 2Položte kadičku na miešaciu dosku a pridajte miešaciu tyčinku. Aby sa všetko rýchlo rozpustilo, použite miešaciu tyčinku a miešaciu dosku, aby bol roztok neustále v pohybe. Miešaciu tyčinku vložte do prázdnej kadičky, aby ste predišli postriekaniu.
- Pred zapnutím miešacej platne počkajte, kým v kadičke nie je roztok.
- 3Do 2-kadičky odmerajte 700 ml destilovanej vody a potom zapnite miešaciu dosku. Chcete začať s menším objemom, ako je konečný objem, pretože objem sa zmení, keď doň pridáte zlúčeniny. Potom, čo je všetko pridané a rozpustené, pridáte zvyšok vody tak, aby bol celkový objem až 1-L. Odmerajte 700 ml vody s odmerným valcom a nalejte ju priamo do čistej kadičky.
- Akonáhle sa pridá voda, zapnite miešaciu dosku na stredné otáčky. Keď sa miešadlo začne otáčať, vo vode by ste mali vidieť malú vírivku.
- 4Odvážte správne množstvo každej chemikálie. Odváži sa 80 g chloridu sodného, 2 g chloridu draselného, 14,4 g Na 2 HPO 4, a 2,4 g KH 2 PO 4. Odvážte každú chemikáliu jednotlivo v člne s vlastnou hmotnosťou.
- Ak pridáte priveľa chemikálií, jednoducho ich odstráňte, kým nebudete mať správne množstvo.
- 5Rozpustite všetky chemikálie v roztoku. Pridajte každú chemikáliu do vody, kým sa mieša. Neexistuje žiadny špeciálny príkaz na pridanie každého z nich, takže môžete pridať všetko naraz. Pokračujte v miešaní, kým sa všetok prášok úplne nerozpustí.
- Rozpustenie bude trvať najmenej 5-10 minút, nechajte ho premiešať a skontrolujte ho neskôr.
- 6Zaistite, aby bolo pH roztoku 7,4. Keď je všetko úplne rozpustené, musíte skontrolovať pH pufra a upraviť ho na 7,4. Ponechajte miešaciu tyčinku zapnutú a ponorte hrot pH metra do hornej časti roztoku. Nechajte čísla na pH metri prestať sa pohybovať, aby sa zmeralo aktuálne pH. Roztok bude pravdepodobne príliš kyslý, takže budete musieť pridať zásaditejší roztok hydroxidu sodného (NaOH).
- Pomocou malej pipety pridajte NaOH niekoľko kvapiek naraz. Po každom pridaní nechajte roztok chvíľu premiešať a počkajte, kým sa čísla neprestanú pohybovať. Pokračujte v pridávaní NaOH, kým nedosiahnete 7,4.
- PH roztoku je proces, ktorý vyžaduje trpezlivosť. Ak náhodou prekročíte hodnotu 7,4, môžete pridať niekoľko kvapiek kyseliny chlorovodíkovej (HCl), aby sa teplota opäť znížila.
- 7Pridajte vodu tak, aby konečný objem bol 1 liter. Pri správnom nastavení pH doplňte roztok na konečný objem 1 liter. Opatrne nalejte celý roztok z kadičky do 1-litrového odmerného valca. Pridajte dostatok destilovanej vody na objem 1 l.
- Konečný roztok nalejte do 1-litrovej sklenenej fľaše bezpečnej na autoklávovanie.
- 8Na sterilizáciu roztoku použite autokláv. Na fľašu nasaďte vrchnák, ale neskrutkujte ho úplne nadol. Proces v autokláve produkuje paru, ktorá môže spôsobiť nárast tlaku vo fľaši. Ak je veko utiahnuté, fľaša môže explodovať. Pri autoklávovaní držte pásik autoklávu cez viečko na mieste.
- Nastavte autokláv na sterilizáciu 20 minút pri 15 psi v kvapalinovom cykle.
- Páska do autoklávu má indikátor teploty. Ak dosiahne správnu teplotu, páska sčernie. Ak páska nezčerná, autokláv sa dostatočne nezahreje a budete musieť znova sterilizovať.
- 9PBS uchovávajte pri izbovej teplote. Po autoklávovaní nechajte PBS pred zatiahnutím veka úplne vychladnúť. Pokiaľ veko dotiahnete ešte horúce, môže to spôsobiť podtlak, ktorý veko neskôr bude veľmi ťažké odstrániť. PBS je pri izbovej teplote dlhodobo stabilný.
- PBS môžete tiež alikvotovať do menších kontajnerov, aby ste ich mohli používať naraz.
Aby ste predišli postriekaniu vodou, vložte miešaciu tyčinku do prázdnej kadičky a potom ju dajte na tanier.
Metóda 3 z 3: zriedenie 10x zásobného roztoku na 1x
- 1Stanovte množstvo 1x roztoku, ktoré budete potrebovať. Najprv musíte vedieť, koľko 1X akcií chcete, aby ste mohli vypočítať, koľko 10X akcií budete potrebovať. Suma, ktorú musíte urobiť, bude závisieť od typu experimentu, ktorý robíte.
- Ak potrebujete alikvotnú časť 1X zásoby, urobte asi 500 ml. Túto 1X zásobu môžete chvíľu používať a nebudete ich musieť robiť tak často.
- 2Vypočítajte potrebné množstvo 10 -násobku zásoby. Na výpočet potrebného 10 -násobného skladu jednoducho vydelíte celkový objem číslom 10. Nezabudnite, že ak chcete získať správny objem, musia sa vaše jednotky zhodovať: ak je objem, ktorý vytvárate, v mililitroch, pridaný objem bude v mililitroch.
- Napríklad: Ak chcete 500 ml roztoku, rozdeľte 500 na 10 a dostanete 50 ml. Na výrobu 500 ml 1X potrebujete 50 ml 10x zásoby.
- Napríklad: Ak chcete 2 litre roztoku, rozdeľte 20 a dostanete 0,2 litra. Toto môžete previesť na ml vynásobením 1 000. Potrebujete 200 ml 10X zásoby na výrobu 2 l 1 x.
- 3Od celkového objemu odpočítajte 10 -násobný objem. Aby ste určili množstvo vody potrebné na zriedenie 10 -násobnej zásoby, stačí odpočítať vypočítaný 10 -násobný objem od celkového požadovaného objemu.
- Napríklad: Na výrobu 500 ml potrebujete 50 ml 10 -násobného zásobného roztoku. Pretože 500 - 50 = 450, potrebujete na zriedenie zásoby 450 ml destilovanej vody.
- 410x vývar zrieďte destilovanou vodou. Pomocou objemov, ktoré ste vypočítali, pridajte destilovanú vodu k 10 -násobku zásoby. Teraz ste urobili 1X zásobu PBS.
- Napríklad pridajte 50 ml 10X zásoby do 450 ml destilovanej vody, aby ste vytvorili 1X zásobu PBS. Roztočením nádoby premiešajte roztok.
- 5Skontrolujte ph 1x zásoby. Niekedy proces riedenia ovplyvňuje pH pufra. Po zriedení je rozumné skontrolovať pH 1X zásoby a uistiť sa, že je na 7,4.
- Na meranie pH použite pH meter a pomocou HCl alebo NaOH upravte pufer na pH 7,4.
Miešaciu tyčinku vložte do kadičky a umiestnite kadičku na miešaciu dosku.
- S chemikáliami používanými na výrobu PBS je bezpečné manipulovať, ale pri práci v laboratóriu je dôležité vždy používať vhodné ochranné prostriedky.
- V laboratóriu noste rukavice, laboratórny plášť a ochranu očí.
- Pri práci v laboratóriu vždy dodržiavajte bezpečnostné protokoly.
- Aj keď ich na výrobu PBS nepotrebujete, vždy vedzte, kde sú vaše núdzové sprchy a výplachy očí.
Prečítajte si tiež: Ako citovať poéziu v eseji?
