Ako urobiť bunkovú kultúru?
Obráťte sa na výrobcu bunkových línií, aby ste určili ideálne kultivačné médium pre bunky, ktoré používate.
Bunková kultúra je komplexný postup, ktorý môžu vykonávať iba profesionálni laboratórni pracovníci, pretože vyžaduje veľa špeciálneho školenia a vybavenia. Tento proces zahŕňa odobratie malej vzorky buniek zo živočíšneho tkaniva a povzbudenie buniek k množeniu. Použitie aseptických postupov, výber ideálnej kultúry a média a udržiavanie buniek v priateľskom prostredí pomáha zaistiť dobrú proliferáciu. Profesionáli začínajú tým, že si nastavia pracovnú oblasť, a potom si vyberú najlepšie materiály pre kultiváciu buniek pre experiment. Potom je dôležité novo kultivované bunky monitorovať a podľa potreby subkultivovať, aby sa v procese pokračovalo.
Metóda 1 z 3: Príprava pracovného priestoru
- 1Nastavte aseptický pracovný priestor a sterilizujte svoje zariadenie. Postriekajte pracovný povrch a vnútornú stranu odsávača bunkových kultúr sprejom s obsahom 70% alkoholu. Chlornany, fenoly a alkoholy sa bežne používajú aj na sterilizáciu zariadenia v laboratóriu, ale skontrolujte, čo je vo vašom laboratóriu k dispozícii.
- Odstráňte všetky nepotrebné položky z pracovného priestoru, aby ste znížili neporiadok. Neukladajte položky na rovnaké miesto, kde vykonávate kultiváciu buniek.
- Uistite sa, že necháte ventilátor odsávača bunkových kultúr zapnutý. Nevypínajte, pokiaľ odsávač pár nebudete dlhší čas používať.
- Ak máte otázky o tom, čo použiť na sterilizáciu pracovného priestoru, obráťte sa na vedúceho laboratória.
- 2Umyte si ruky a dajte si osobné ochranné prostriedky. Na umývanie rúk používajte antibakteriálne mydlo a teplú vodu. Potom si na experiment oblečte rukavice, plášť, okuliare, masku a všetky ďalšie potrebné osobné ochranné prostriedky.
- Nezabudnite si zopnúť vlasy, ak sú dlhé, takže vám budú prekážať.
- 3Sterilizujte všetky činidlá, roztoky alebo iné médiá, ktoré budete používať. To môže zahŕňať použitie autoklávu alebo sterilného filtra. Pred pokusom o sterilizáciu si prečítajte pokyny pre typ média, ktoré používate.
- Banku ihneď uzatvorte po sterilizácii média, aby ste zabránili kontaminácii.
Použite rovnaký typ substrátu alebo suspenzného média, aké ste použili na počiatočnú kultiváciu buniek. - 4Aby ste zabránili kontaminácii, dodržujte sterilné manipulačné postupy. Kontaminácia bunkového média chemickými alebo biologickými látkami môže experiment pokaziť. Chemické kontaminanty zahrnujú detergenty, vodu, endotoxíny a kontaminanty v médiu bunkových kultúr. Medzi biologické kontaminanty patria plesne, kvasinky, baktérie, vírusy a mykoplazmy. Aby sa tieto kontaminanty nedostali do média pre bunkovú kultúru, vždy dodržujte aseptickú techniku.
- Na prenos média do banky je napríklad najlepšie použiť pipetu, pretože nalievanie média zvyšuje riziko kontaminácie.
Tip: Vždy pracujte pomaly a premyslene, aby ste zaistili zachovanie sterilného pracovného priestoru.
Metóda 2 z 3: výber buniek, kultúry a média
- 1Vyberte vhodnú bunkovú líniu pre svoje experimenty. Široký sortiment línií živočíšnych buniek môžete získať od komerčných alebo neziskových dodávateľov. Skontrolujte, aké typy buniek sú k dispozícii, a vyberte ten, ktorý je pre váš experiment najvhodnejší. Uistite sa, že si vyberiete vysokokvalitnú bunkovú líniu, aby ste zvýšili šance na úspešný experiment. Niektoré kritériá, ktoré by ste mohli zvážiť, zahŕňajú:
- Druh bunky
- Funkčné charakteristiky buniek
- Či už budete potrebovať konečné alebo spojité bunkové rady
- Ideálne rastové podmienky a vlastnosti
- Či už potrebujete normálne alebo transformované bunky
Varovanie: Nikdy sa nepokúšajte kultivovať bunky odobraté niekomu, kto pracuje v laboratóriu. Náhodné zavedenie týchto buniek späť do tela osoby môže mať za následok zhubné ochorenie.
- 2Pre väčšinu typov buniek používajte priľnavú kultúru. Adherentná kultúra je umelý substrát, na ktorý sa bunky navrstvia. Tento typ kultúry funguje najlepšie pre väčšinu živočíšnych buniek, pretože na proliferáciu vyžadujú substrát, na ktorom sa opierajú. Najlepšie je však skontrolovať špecifikácie bunkovej línie, ktorú používate, aby ste zistili, či tento typ kultúry potrebujete.
- Po pridaní média do buniek v adherentnej kultúre sa na bunky pozrite pod mikroskopom, aby ste zistili, či sa uvoľnili zo substrátu. Rozprestrú sa, ak sa uvoľnia zo substrátu.
- 3Vyberte suspenznú kultúru pre bunky, ktoré sú na to adaptované. Bunky so zavesením na ničom nespočívajú. Namiesto toho voľne plávajú v kvapaline, čo môže uľahčiť rozšírenie kultúry pomocou pridaného média. Niektoré bunkové línie boli špeciálne upravené na použitie v suspenzii, preto sa pre istotu obráťte na výrobcu bunkových línií. Suspenzné médium je tiež dobrou možnosťou pre bunky, ktoré nie sú lepivé.
- Majte na pamäti, že ak používate suspenznú bunkovú kultúru, budete musieť vykonať denné počítanie buniek.
Majte na pamäti, že ak používate suspenznú bunkovú kultúru, budete musieť vykonať denné počítanie buniek. - 4Vyberte kultivačné médium, ktoré je najvhodnejšie pre vaše bunky. Ideálne kultivačné médium sa bude líšiť v závislosti od toho, aký typ buniek používate. Poraďte sa s výrobcom bunkových línií, aby ste určili ideálne kultivačné médium pre bunky, ktoré používate. Niektoré bežné typy zahŕňajú:
- Sérum
- Bazálne médiá
- Médiá so zníženým sérom
- Médiá bez séra
Metóda 3 z 3: monitorovanie buniek
- 1Skontrolujte hladiny ph a co2 bunkového média. Stredné hladiny CO2 sa najlepšie udržiavajú medzi 4 až 10% pre všetky bunkové línie. Ideálna hladina pH média sa však bude líšiť v závislosti od typu buniek, ktoré používate, preto vždy skontrolujte úroveň pH vašej bunkovej kultúry. Obráťte sa na výrobcu bunkových radov a získajte podrobnosti o ideálnej hladine pH alebo použite bežné odporúčané hodnoty pH pre typy buniek, ktoré používate.
- Cicavčie bunky napríklad rastú najlepšie s pH 7,4, ale hmyzie bunky rastú najlepšie s pH 6,2.
- 2Regulujte teplotu, aby ste dosiahli optimálne prostredie. Niektoré bunky budú prosperovať iba v úzkom teplotnom rozsahu, zatiaľ čo iné bunky môžu prosperovať v širšom rozsahu teplôt. Zvážte typ článkov, ktoré používate, a upravte okolitú teplotu, pri ktorej články udržiavate na ideálnej úrovni. K niektorým bežným teplotným odporúčaniam patrí:
- Ľudské a cicavčie bunky- 36 až 37°C (97 až 37°C)
- Bunky hmyzu- 27°C
- Vtáčie bunky- 38,5°C (101, -16°C)
- Chladnokrvné bunky- 15 až 26°C (59 až 26°C)
Profesionáli začínajú tým, že si nastavia pracovnú oblasť, a potom si vyberú najlepšie materiály pre bunkové kultúry pre experiment. - 3Bunky spočítajte pomocou hemocytometra bezprostredne po začiatku kultivácie. Hemocytometer je šošovka podobná mriežke, ktorá prechádza pod bunkami pod mikroskopom. To vám umožní jednoduchšie počítanie buniek rozdelením buniek na kvadranty a iné menšie segmenty.
- Nezabudnite na hemocytometri zaznamenať počet buniek v každej mriežke, aby ste pri nasledujúcom počítaní mohli určiť, či sa bunky množia.
Tip: Pomocou klikača uľahčíte sledovanie počtu buniek v kultúre.
- 4Bunky subkultivujte, akonáhle sa zdvojnásobia. Potom, čo sa počet buniek v médiu zdvojnásobí, môžete ich subkultivovať a pokračovať v raste tak, že bunky rozdelíte do 2 nádob a do každej pridáte čerstvé médium. Použite rovnaký typ substrátu alebo suspenzného média, aké ste použili na počiatočnú kultiváciu buniek.
- Bunky rozdeľte do 2 baniek tak, aby v každej bola polovica, potom do nádoby pridajte 3 diely nového média tak, aby bolo médium 25% staré a 75% nové.
- Mydlo
- Rukavice
- Róba
- Maska
- Kapucňa na bunkové kultúry
- Dezinfekčný čistiaci prostriedok
- Bunková kultúra
- Bunkové kultivačné médium
- Bunková línia
- Pipety
- Mikroskop
- Hemocytometer
- Clicker (na počítanie buniek)
Prečítajte si tiež: Ako rýchlo rozpustiť ľad?
