Ako pripraviť akrylamidový gél?

Petra Holubová
Petra Holubová
• 8 min čítanie
Keď odliate akrylamidový gél
Na dosiahnutie najlepších výsledkov pripravte čerstvú dávku roztoku APS vždy, keď odliate akrylamidový gél.

Akrylamidové gély sú kľúčovou súčasťou elektroforézy, procesu, ktorý zahŕňa separáciu rôznych typov molekúl podľa veľkosti. Najčastejšie pozostávajú z chemických zlúčenín akrylamidu a bisakrylamidu spolu s pufrom s vhodným pH, zdrojom voľných radikálov a špeciálnym stabilizátorom, ktorý slúži na naštartovanie polymerizácie. Hneď ako gél stuhne, môže sa použiť na analýzu DNA, RNA a rôznych proteínových formácií.

Časť 1 z 3: miešanie rezolučného alebo stohovacieho gélu

  1. 1
    Pridajte primerané základné množstvo ddh 2 o do 10 ml kónickej injekčnej liekovky. Použite pipetu stlačiť DDH 2 O do fľaštičky pomaly. Dávajte pozor, aby ste nepridali viac alebo menej, ako je množstvo požadované receptom, ktorý sledujete, ktorý sa bude líšiť v závislosti od konkrétneho formátu (typu proteínu), ktorý chcete analyzovať.
    • "DDH 2 O" je chemická skratka pre "dvakrát destilovanej vode", čo je voda, ktorá bola čistená na úroveň vhodnú pre citlivé laboratórne aplikácie.
    • Ak chcete 12% beží gélu, napríklad, by sa začať s 1650μl DDH 2 O. mikrolitrov (ul), je veľmi malý kvapalina meraní, ktoré zodpovedajú jednej milióntiny litra.
  2. 2
    Pokračujte vhodnou koncentráciou dodecylsulfátu sodného (SDS). Na prenesenie SDS do miešacej injekčnej liekovky použite samostatnú, čistú pipetu. Karta SDS „zamaskuje“ vnútorný náboj vašich testovaných proteínov a poskytne im všetky podobný pomer náboja k hmotnosti. Keď sa na gél aplikuje elektrické pole, spôsobí to, že rôzne proteíny migrujú k anóde rôznymi rýchlosťami na základe ich hmotnosti.
    • Pri každom pridaní novej zložky do gélu prepnite na novú pipetu.
  3. 3
    Zahrňte 30% roztok akrylamidu. Štandardné akrylamidu riešenie spočíva akrylamidových izolátov infúziu v ultra čistej vode. Roztok akrylamidu bude slúžiť ako matrica na separáciu proteínov a nukleových kyselín.
    • V prípade potreby si môžete pripraviť vlastný 30% roztok zmiešaním 30% (hmotn./obj.) Akrylamidu a 1,0% N, N'-metylén-bisakrylamidu vo vhodnej koncentrácii vody.

    Varovanie: Pri práci so zmesami akrylamidu a bisakrylamidu vždy noste rukavice. Oba roztoky sú neurotoxíny, ktoré by mohli mať vážne škodlivé následky, ak by sa absorbovali na holú pokožku.

  4. 4
    Pridajte potrebné množstvo 1,5 m tris-hci ph 8,8. Opäť použite čerstvú pipetu a dávajte pozor, aby ste pridali presné množstvo. Pridanie Tris-HCI zaistí, že zmiešané zložky vo vašej gélovej zmesi zostanú na konštantnom pH.
    • Tris-HCI (skratka pre „tris (hydroxymetyl) aminometán hydrochlorid“) je typ pufra bežne používaného v chemických postupoch a experimentoch.
  5. 5
    Infúzia 10% persíranu amónneho (APS). APS je silné oxidačné činidlo, ktoré sa často používa ako ko-katalyzátor v chémii polymérov. Spolu s TEMED je nevyhnutný na začatie polymerizácie, komplexného procesu vytvárania väzieb, ktorý spôsobí, že kvapalná zmes stuhne na gél.
    • Na dosiahnutie najlepších výsledkov pripravte čerstvú dávku roztoku APS vždy, keď odliate akrylamidový gél.
  6. 6
    Na katalyzáciu reakcie pridajte tetrametyletyléndiamín (TEMED) ako posledný. Akonáhle skončíte s spájaním zvyšných komponentov, zatlačte na vrch TEMED. TEMED je primárny katalyzátor používaný v gélovej elektroforéze. Spustí polymerizáciu hneď, ako vstúpi do zmesi, takže buďte pripravení nalievať gél bezprostredne po pridaní.
    • Je dôležité pridať TEMED ako posledné, pretože je zodpovedný za uvedenie reakcie do pohybu.
    • Tu opísaný postup (ako aj poradie pridávania) je možné zopakovať aj pri príprave stohovacích gélov-jediným rozdielom budú presné množstvá jednotlivých zložiek.
Štandardný roztok akrylamidu pozostáva z izolátov akrylamidu infúznych v ultračistej vode
Štandardný roztok akrylamidu pozostáva z izolátov akrylamidu infúznych v ultračistej vode.

Časť 2 z 3: montáž odlievacieho zariadenia

  1. 1
    Tenký tanier položte na hrubý plech a zarovnajte okraje dvoch tanierov. Gelová elektroforéza sa vykonáva vo vnútri plášťa tvoreného dvoma oddelenými sklenenými doskami, z ktorých jedna je o niečo hrubšia ako druhá. Ak chcete začať stavať tento obal, položte „krátky“ tanier na vrch „vysokého“ taniera a tenší tanier navrch.
    • Hrubšia z dvoch dosiek má vstavané rozpery, ktoré pri priliehaní k tenšej doske vytvoria úzku komoru.
  2. 2
    Naskladané dosky zasuňte do otvoru v hornej časti odlievacieho rámu. Krátka doska by mala smerovať k prednej strane rámu, pričom vysoká doska a medzery by mali byť viditeľné z opačnej strany. Akonáhle platne tesne spočívajú vo vnútri rámu, otočte sklopné „brány“ na oboch stranách rámu dozadu, aby sa upli na svoje miesto.
    • Skontrolujte, či je spodný okraj tvorený dvojicou zarovnaných dosiek dokonale rovnobežný so spodkom lejacieho rámu a pod ním ležiacou pracovnou plochou.
    • Odlievací rám je typicky tvarovaný zo zeleného plastu, čo ho robí okamžite odlíšiteľným od zvyšku zariadenia.
  3. 3
    Odlievací rám umiestnite do tela lejacieho stojana. Nadvihnite svorku v tvare U v hornej časti stojana, vložte rám krátkou doskou smerom von a potom ho opäť sklopte, aby sa rám zaistil nadol. Otestujte spojenie medzi týmito dvoma kusmi, aby ste sa presvedčili, že sa rám neposúva ani nepohybuje vo vnútri stojana.
    • Po zostavení by mal byť medzi dvoma doskami dostatok priestoru na vloženie vašej gélovej zmesi.

    Tip: Ak chcete, môžete komoru otestovať na prípadné netesnosti tak, že do medzery medzi doskami zapojíte asi 1 mililiter deionizovanej vody. Keď ste spokojní, opatrne vypustite vodu alebo zasuňte do medzery list filtračného papiera, aby nasal prebytočnú tekutinu.

Roztok akrylamidu bude slúžiť ako matrica na separáciu proteínov
Roztok akrylamidu bude slúžiť ako matrica na separáciu proteínov a nukleových kyselín.

Časť 3 z 3: naliatie gélu

  1. 1
    Naplňte tekutú gélovú zmes do otvoru v hornej časti komory. Na pridanie zmesi použite sklenenú pipetu a žiarovku, až kým nebude vyrovnaná s vyznačenou ryskou na vonkajšej strane skleneného puzdra. Nebojte sa žiadnych vzduchových bublín, ktoré môžete vidieť vo vnútri obalu-budete s nimi zaobchádzať skôr, ako necháte gél úplne polymerizovať.
    • Ak zariadenie, ktoré používate, nemá čiaru plnenia, zmerajte asi 1 centimeter (0,39 palca) nadol od hornej časti skleneného „okna“ viditeľného vo vnútri odlievacieho rámu a urobte tam značku pomocou fixky s plsteným hrotom.
  2. 2
    Nalejte vrstvu etylalkoholu, izopropanolu alebo n -butanolu, aby sa zmes odplynila. Naplňte čerstvú pipetu zvoleným alkoholom a pomaly ju vláčite do komory plynulým pohybom tam a späť. Pokračujte v lúhovaní alkoholu, kým nevyplní zostávajúci priestor vo vnútri obalu, asi 1 cm (0,39 palca).
    • Alkoholový krycí roztok pomôže nielen rozpustiť zachytený kyslík, ale tiež zabráni tomu, aby sa do hotovej gélovej zmesi dostali všetky ostatné plyny z prostredia.
    • Nie je spravidla potrebné odplyňovať naukladané gély, pretože oddelené vrstvy fungujú ako jedna súvislá matrica, čo umožňuje vzorkám proteínov voľne migrovať gélom pod vplyvom elektriny.

    Alternatíva: Odkvapkajte kvapalnú gélovú zmes vo vákuu najmenej 15-20 minút, než pridáte APS a TEMED.

  3. 3
    Nechajte gél vytvrdnúť najmenej 20-30 minút pri izbovej teplote. Teraz už stačí len nastaviť časovač a nechať gél nerušene pôsobiť zhruba pol hodiny. Počas tejto doby skončí polymerizácia a postupne stvrdne na hustý gél.
    • Počas polymerizácie sa vyhnite pohybu, tlačeniu, pridávaniu čokoľvek alebo iným spôsobom zasahujúcim do gélu.
    • Pokiaľ vám to čas dovolí, môžete predĺžiť svoj vyhradený čas polymerizácie na 45-60 minút, aby ste si boli istí, že gél mal šancu úplne stuhnúť.
  4. 4
    Akonáhle je váš gél tuhnutý, vypustite alebo absorbujte alkoholový krycí roztok. Alkohol nalejte do chemickej výlevky alebo vhodnej nádoby na likvidáciu tekutého odpadu alebo ho pomocou listu filtračného papiera nasajte. Teraz máte možnosť svoj gél ihneď použiť alebo ho uložiť pre budúcu analýzu.
    • Niektorí chemici tiež odporúčajú opláchnuť horný povrch odliateho gélu malým množstvom deionizovanej vody.

Tipy

  • Erlenmeyerove banky sú tiež užitočné na miešanie akrylamidových roztokov a gélov, pretože ich zúžené hrdlá obmedzujú množstvo potenciálne toxických výparov, ktoré môžu unikať.
  • Pred začatím odlievania sa uistite, že sú vaše sklenené platne čisté a bez prasklín, triesok alebo iného poškodenia.

Varovania

  • Niektoré z rizík spojených s prácou s akrylamidmi zahŕňajú otravu nervového systému, poškodenie alebo abnormálne účinky na reprodukčné orgány, interferenciu s produkciou hormónov a zvýšené riziko rakoviny.
  • Mnoho chemikálií používaných na prípravu elektroforéznych gélov je v rôznej miere leptavých a pri kontakte s pokožkou môže spôsobiť mierne až silné podráždenie.
V prípade potreby si môžete pripraviť vlastný 30% roztok zmiešaním 30% (hmotn./obj.) Akrylamidu
V prípade potreby si môžete pripraviť vlastný 30% roztok zmiešaním 30% (hmotn./obj.) Akrylamidu a 1,0% N, N'-metylén-bisakrylamidu vo vhodnej koncentrácii vody.

Veci, ktoré budete potrebovať

  • 10 ml kónického gélu alebo Erlenmeyerovej banky
  • Pipeta
  • Latexové alebo nitrilové rukavice
  • DDH 2 O
  • Dodecylsulfát sodný (SDS)
  • 30% roztok akrylamidu
  • 1,5M Tris-HCI pH 8,8
  • Persíran amónny (APS)
  • Tetrametyletyléndiamín (TEMED)
  • Krátky tanier
  • Vysoká rozperná doska
  • Odlievacia forma
  • Odlievací stojan
  • Sklenená pipeta a žiarovka
  • Etylalkohol, izopropanol alebo n -butanol
  • Časovač
  • Deionizovaná voda (voliteľné)
  • Filtračný papier (voliteľné)
  • Fixka s plsteným hrotom (voliteľné)
Prečítajte si tiež: Ako používať, aj keď vo vete?

Prečítajte si tiež:

  1. Ako kalibrovať a používať pH meter?
  2. Ako neutralizovať bielidlo?
  3. Ako testovať na CO₂?
Súvisiace články
  1. Ako sa dozvedieť o chémii prechodných kovov?Zora Nemcová
  2. Ako si zorganizovať školskú prácu?Viktor Stodola
  3. Ako používať „AKA“?Ľubomíra Holéczyová
  4. Ako pluralizovať skratky, akronymy a inicializmyDenisa Kravjarová
  5. Ako používať zaistené, zaistené a poistenéRNDr. Melinda Tóthová Th.D.
  6. Ako rozoznám rozdiel medzi prehrou a prehrou?Petra Holubová
FacebookTwitterInstagramPinterestLinkedInGoogle+YoutubeRedditDribbbleBehanceGithubCodePenWhatsappEmail