Ako navrhnúť priméry PCR?
Tento článok ukazuje, ako navrhnúť PCR priméry s príkladom Primer-BLAST. Časť 1 zo 4: príprava.
Polymerázová reťazová reakcia (PCR) je technika, ktorá má rôzne aplikácie vo výskume, medicíne a forenznej oblasti. Zosilňuje požadovaný fragment DNA. Je to tiež citlivý test na diagnostiku chorôb a genotypizáciu. Medzi základné zložky reakčného systému patrí templát DNA, roztok pufra, deoxyribonukleozidtrifosfát (dNTP), polymeráza Taq a pár primerov. (predný a zadný). Správne navrhnuté priméry znižujú náklady a čas strávený experimentovaním. Primer-BLAST je účinný nástroj na nájdenie primerov špecifických pre šablónu. Tento nástroj je voľne použiteľný a nevyžaduje inštaláciu softvéru ani znalosti programovania. Tento článok ukazuje, ako navrhnúť PCR priméry s príkladom Primer-BLAST.
Časť 1 zo 4: príprava
- 1Prejdite na webovú stránku primer-blast ( https://ncbi.nlm.nih.gov/tools/primer-blast/). Všimnite si, že prístup k RefSeq je preferovaný formát šablóny. Kolekcia Reference Sequence (RefSeq) je sekundárnou databázou s nadbytočnými informáciami vybranými z primárnej databázy GenBank.
- Primer-BLAST je nástroj na navrhovanie primerov vyvinutý Národným centrom pre biotechnologické informácie (NCBI).
- NCBI ako národný zdroj informácií o molekulárnej biológii spravuje biologické databázy a uľahčuje používanie týchto databáz.
- Pretože všetky genetické informácie získané biologickými výskumami sa nakoniec ukladajú do databáz spravovaných NCBI, Primer-BLAST je vhodný pre akýkoľvek organizmus, pokiaľ sú zvolené správne parametre.
- 2Rozhodnite o účele primerov. Účel ovplyvňuje návrh základného náteru. Parametre, ako je dĺžka produktu PCR a umiestnenie primérov, do značnej miery závisia od účelu. Či už ide o amplifikáciu celého génu, alebo o kontrolu prítomnosti génu, o zistenie úrovne jeho expresie, alebo o iné účely?
- Zober si príklad. Nech je požadovaným génom nádorový supresorový gén p53 v modelovom organizme Drosophila melanogaster (obyčajná ovocná muška).
- Cieľom je zistiť úroveň expresie tohto génu.
- V tomto prípade sa priméry namiesto genómu viažu na reverzne transkribovanú komplementárnu DNA (cDNA) z messengerovej RNA (mRNA). Templát sa tak zužuje na kódujúcu sekvenciu (CDS) p53.
- 3Poznáte šablónu PCR. Zdroj nukleotidových sekvencií sa líši v závislosti od odlišnej situácie výskumu. Je možné ho vygenerovať pomocou výsledku sekvenovania alebo ho získať z databázy. Ak je to zo surového výsledku sekvenovania, prejdite priamo na časť „Beh BLAST pre surovú sekvenciu“. Ak je to z databázy, chvíľu sa s tou databázou zahrajte.
- V prípade génu p53 Drosophila melanogaster je anotovaná sekvencia k dispozícii v databáze NCBI.
- Prejdite na domovskú stránku NCBI (https://ncbi.nlm.nih.gov/).
- Zadajte kľúčové slová do vyhľadávacieho panela. Na tomto paneli sú logické operátory, ako napríklad AND, OR, NOT.
- Kliknite na tlačidlo Hľadať a preskúmajte informácie o géne Drosophila melanogaster p53.
- 4Získajte prístup k sekvenciám nájdeným v databáze. Primer-BLAST identifikuje templát lepšie podľa vstupu RefSeq než podľa sekvencie surovej DNA. Ďalšou výhodou pristúpenia k RefSeq je, že funkcie súvisiace s exónom / intrónom sú k dispozícii iba vtedy, ak ako templát PCR zadáte sekvenciu mRNA RefSeq.
- Ak je sekvencia získaná z online databázy, jednoducho vyhľadajte kľúčové slová na domovskej stránke NCBI a získajte prístup k RefSeq.
- Potom preskočte časť „Beh BLAST pre surovú sekvenciu“ a prejdite priamo na časť „Úprava parametrov“.
Parametre, ako je dĺžka produktu PCR a umiestnenie primérov, do značnej miery závisia od účelu.
Časť 2 zo 4: Spustenie BLASTu pre nespracovanú sekvenciu
- 1Prístup k databáze refseq pre prístup k nespracovanej sekvencii. Súvisiace pristúpenie k RefSeq je prístupné pomocou základného miestneho vyhľadávacieho nástroja zarovnania (BLAST). Nájsť prístup k RefSeq surovej sekvencie znamená vyhľadať v databáze NCBI sekvenciu identickú s touto surovou sekvenciou.
- Pokračujte príkladom. Na ukážku predpokladajme, že gén Drosophila melanogaster p53 nie je anotovaný. Ak chcete získať jeho surovú postupnosť, navštívte databázu Drosophila (http://flybase.org). Do poľa Prejsť na génový panel zadajte „p53“. Bude navigovaný k tomuto génu. Nájdite CDS génu Drosophila melanogaster p53.
- Otvorte webovú stránku BLAST (https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi).
- Pretože v tomto prípade porovnáva sekvenciu DNA s inou sekvenciou DNA, kliknite na tlačidlo nukleotidové BLAST.
- 2Skopírujte sekvenciu alebo si stiahnite FASTA z flybase. FASTA je štandardný formát na ukladanie nukleotidových kódov v bioinformatike. Tento typ súboru môžu otvárať a upravovať takmer všetky nástroje na spracovanie textu.
- 3Spustite BLAST. Prilepte CDS do poľa sekvencie dotazu. Posuňte zobrazenie nadol a kliknutím na položku RÝCHLO spustite miestne zarovnanie.
- 4Vyberte prístup refseq, ktorý zodpovedá cieľovej šablóne. Dávajte pozor na informácie uvedené vo výsledku BLAST. Určte vhodné pristúpenie.
- Identita zarovnania by podľa všetkého mala byť 100%, aby sa zaistilo, že pristúpenie RefSeq predstavuje cieľovú šablónu.
- Ak neexistuje žiadny prístup so 100% identitou, znamená to, že sekvencia dotazov je zle preštudovaná. V tomto prípade použite nespracovanú sekvenciu pre Primer-BLAST. Uložte túto novú sekvenciu do GenBank a prispejte do databázy biológie.
- Ďalším kľúčovým bodom je zhoda s popisom, ktorý hovorí o organizme a názve sekvencie.
- V tomto prípade sú vhodnými doplnkami ako RefSeq NM_001170223,1, tak aj nasledujúci. Je dobré vybrať si jednu z nich.
- 5Vykonajte párové zarovnanie pre vybranú referenčnú sekvenciu a cieľovú šablónu. Majte na pamäti, že referenčná sekvencia s priradeným prístupom zvyčajne nemá rovnakú dĺžku ako cieľová šablóna. Párové zarovnanie môže nájsť presne rovnakú oblasť.
- Prejdite na webovú stránku nástroja na párové zarovnanie sekvencií na EMBL-EBI (https://ebi.ac.uk/Tools/psa/).
- Vyberte miestny algoritmus zarovnania.
- V príklade detekcie úrovne expresie génu Drosophila melanogaster p53 skopírujte a vložte sekvenciu NM_001170223,1 do jedného z boxov; p53-RC CDS druhý box.
- Program spustíte kliknutím na tlačidlo Odoslať.
- 6Pozície zaznamenajte do referenčnej sekvencie, kde sa dva fragmenty zarovnávajú. Prvé a posledné číslo v zarovnaní predstavujú počiatočný a koncový bod, kde sa tieto dva fragmenty zarovnávajú.
- V tomto prípade výsledok naznačuje, že CDS p53-RC začína na 630. a končí na 1787. nukleotide sekvencie NM_001170223,1.
- Tu je dôvod vykonať miestne zarovnanie. Nástroj na zarovnanie na EMBI-EBI vráti výsledok v textovom formáte. Je ťažké spočítať pozície bez mriežky. Pohodlne, výsledok lokálneho zarovnania, ktorý vráti, vynechá nezarovnané oblasti a zobrazí zarovnané polohy priamo.
V tomto prípade sa priméry namiesto genómu viažu na reverzne transkribovanú komplementárnu DNA (cDNA) z messengerovej RNA (mRNA).
Časť 3 zo 4: úprava parametrov
- 1Zadajte informácie o templáte PCR do primer-blast.
- V tomto prípade je prístupovým bodom RefSeq NM_001170223,1.
- Predný primer z polohy je 630.
- Reverzný primer do polohy je 1787.
- Vyššie uvedené dva parametre obmedzujú rozsah v oblasti CDS p53-RC. Sú zbytočné, ak šablóna nie je prístupom RefSeq získaným zo surovej sekvencie BLAST.
- 2Upravte parametre základného náteru. V Primer-BLAST sú hodnoty parametrov, ktoré sa líšia od predvolených hodnôt, systémom automaticky zvýraznené žltou farbou.
- Na účely detekcie úrovne génovej expresie v tomto prípade stačí relatívne krátky produkt PCR.
- Minimálna a maximálna veľkosť produktu PCR je teda nastavená na 100, respektíve 250.
- 3Upravte výber exónu/intrónu. Tento krok nie je potrebný pre návrh priméru genómovej DNA. Je to však dôležité pre návrh priméru cDNA, pretože umožňuje výskumníkovi skontrolovať, či v budúcich experimentoch existuje vo vzorke cDNA kontaminácia genómovou DNA.
- V tomto prípade, pretože šablónou je cDNA, zapnite možnosť zahrnutia intrónu.
- Genomická DNA by mala dlhší produkt PCR ako templát cDNA.
- 4Upravte parametre kontroly špecifickosti páru primérov. Zadajte názov organizmu, aby program mohol vyhľadávať v zodpovedajúcej databáze. Pokiaľ ide o prísnosť, čím viac je nesúladov a čím väčší je počet nezhôd potrebných na ignorovanie nezamýšľaných cieľov, tým prísnejšia je špecificita primeru.
- V tomto prípade je organizmom Drosophila melanogaster
- 6 je najvyšší počet nesúladov povolených spoločnosťou Primer-BLAST
- Nesúlad na 3' konci primeru je citlivý. Účinne prerušuje väzbu na nezamýšľané ciele.
- Limit tohto programu na detekciu nezamýšľaného cieľa je až 35% nesúladov, čo znamená 7 nesprávnych párovaní pre primer s 20 nukleotidmi.
- 5Rozbaľte ponuku rozšírených parametrov.
- 6Optimalizujte parametre základného náteru. GC obsah 40-60% dáva teplotu topenia fér. Maximálna prijateľná hodnota poly-X je 4. Po sebe idúcim nukleotidom tej istej bázy by sa malo vo všeobecnosti vyhnúť. Nastavte Max Poly-X na 3, aby sa znížila šanca na nesprávnu prípravu.
- 7Znížte maximálnu komplementaritu seba a páru, aby ste sa vyhli dimérom primerov. Pretože v počiatočných cykloch reakcie PCR je koncentrácia templátu oveľa nižšia ako koncentrácia primérov, ak sa priméry ľahko viažu na seba, niekoľko primérov sa naviaže na templát, aby iniciovalo predĺženie nukleotidového reťazca. Účinnosť zvyšuje obmedzenie počtu komplementárnych nukleotidov v primeroch.
Časť 4 zo 4: získanie primerov
- 1Generujte navrhnuté priméry. Posuňte sa nadol a kliknite na tlačidlo Získať priméry, aby ste získali kandidátov na priméry. Spustenie programu zvyčajne trvá menej ako 2 minúty. Niekedy, najmä počas pracovnej doby, je sever plný kapacity. Požiadavky sa zaradia do zoznamu čakateľov a výsledok môže trvať viac ako pol hodiny. Tip je vyhnúť sa takýmto špičkovým hodinám.
- 2Vyberte z týchto kandidátov 2-3 páry. Jeden pár sa syntetizuje ako prvý. Zostávajúce páry slúžia ako zálohy. Pri výbere záložných primerov z kandidátov je lepšie zvoliť odlišné páry ako podobné. Ak má jeden z párov primérov v experimentálnom teste nízku účinnosť alebo špecificitu. Podobné majú pravdepodobne rovnaký problém.
- V príklade detekcie úrovne expresie génu Drosophila melanogaster p53 je počet párov primérov, ktoré sa majú vrátiť, nastavený na predvolenú hodnotu 10. Program dáva 10 kandidátskych párov primérov.
- Kandidátske priméry sú na účely vysvetlenia zoskupené v rôznych farbách. Pôvodný výsledok vygenerovaný spoločnosťou Primer-BLAST má iba jednu farbu.
- Ak sa najskôr syntetizujú priméry v červenom, ale v experimente to zlyhá, potom môžu byť záložnými farbami priméry v zelenej, žltej alebo čiernej farbe.
- Je však lepšie nevyberať páry primérov v modrej farbe ako zálohu, pretože medzi červenými a modrými základnými nátermi dochádza k prekrývaniu.
- 3Experimentálne skontrolujte kvalitu syntetizovaných primerov. Spustite PCR pomocou syntetizovaných párov primérov. Otestujte jeho účinnosť a špecifickosť analýzou výsledku gélovej elektroforézy alebo analýzou topenia s vysokým rozlíšením (HRMA). Ak priméry v teste neprešli, syntetizujte záložný pár a zopakujte kontrolný krok, kým nenájdete vhodný pár.
- Vysoká jasnosť väzby elektroforézy alebo fluorescencia HRMA naznačuje účinnosť testovaných primerov.
- Jednoduchá väzba v elektroforéze alebo jeden vrchol topenia v HRMA indikuje špecifickosť testovaných primérov.
- V tomto prípade sú priméry navrhnuté pre kvantitatívnu PCR (qPCR). Na kontrolu kvality primerov je dôležité dodržiavať protokol o určovaní účinnosti qPCR.
Pretože v raných cykloch reakcie PCR je koncentrácia templátu oveľa nižšia ako koncentrácia primérov, ak sa priméry ľahko viažu na seba, niekoľko primérov sa naviaže na templát, aby iniciovalo predĺženie nukleotidového reťazca.
- Slovná zásoba (podľa abecedy)
- identita zarovnania: percento identických kódov v dvoch zarovnaných sekvenciách
- komentovaná sekvencia: sekvencia, v ktorej sa identifikujú informácie, ako sú funkcie a umiestnenie
- komplementarita: vlastnosť medzi väzbou nukleotidovej bázy tak, že páry guanínu (G) s cytozínom (C) a adenínu (A) sa spájajú s tymínom (T) alebo Uracil (U)
- DNA: kyselina deoxyribonukleová, polymérna molekula nukleotidov, ktorá nesie genetickú informáciu takmer vo všetkých organizmoch. Väčšina molekúl DNA je dvojvláknová. Každý prameň má koniec 5' a 3'. Dva komplementárne pramene sú navzájom zarovnané antiparalelne a vinú sa, aby vytvorili špirálu
- dNTP: substrát syntézy DNA. Jedna molekula dNTP obsahuje dusíkovú bázu, deoxyribózu a tri fosfátové skupiny
- elektroforéza: technika oddeľovania rôznych molekúl na základe ich veľkosti a náboja
- exón: akákoľvek časť génu, ktorá sa exprimuje v konečnom génovom produkte
- Obsah GC: percento guanínu (G) plus cytozínu (C) v sekvencii
- genóm: celkový genetický materiál organizmu
- intrón: akákoľvek časť génu, ktorá nie je exprimovaná v konečnom génovom produkte
- miestne zarovnanie: určte podobné segmenty dvoch sekvencií v bioinformatike. Lokálne zarovnanie sa týka globálneho zarovnania, ktoré sa pokúša zarovnať celú dĺžku dvoch sekvencií
- analýza topenia: proces, ktorý vykresľuje krivku generovanú disociáciou dvojvláknovej DNA pri teplotnom gradiente, a potom krivku vyhodnotí a zistí vlastnosti DNA.
- mRNA: rodina RNA, ktorá slúži ako medziprodukt v génovej expresii. mRNA odovzdáva informácie z DNA do proteínového produktu
- nukleotid: monomérna jednotka polyméru nukleovej kyseliny. Jeden nukleotid obsahuje dusíkovú bázu, päťuhlíkový cukor a fosfátovú skupinu
- polymeráza: enzým, ktorý katalyzuje syntézu polyméru nukleovej kyseliny
- primer: krátky reťazec nukleovej kyseliny, ktorý slúži ako počiatočný bod predĺženia DNA polyméru. Syntetizovaný fragment je medzi predným a reverzným primerom, pretože smer predĺženia reťazca je vždy od 5' do 3' konca.
- RNA: kyselina ribonukleová, polymérna molekula, ktorá hrá rôznu úlohu v kódovaní, regulácii a expresii génov. Väčšina molekúl RNA je jednovláknová. Každý prameň má koniec 5' a 3'
- templát: reťazec DNA, ktorý poskytuje pôvodnú sekvenciu, ktorá sa má replikovať.
- prepis: skopírujte sekvenciu DNA do jej komplementárnej RNA
- Je veľmi užitočné uložiť parametre vyhľadávania, akonáhle sú hodnoty optimalizované pre určitý typ šablóny. To pomôže vyhnúť sa opakovanej práci nabudúce.
Prečítajte si tiež: Ako demonštrovať archimedov princíp?
